1、xx（细胞/基因/病原/其他造模因素）信息

利用 CRISPR/Cas9技术，特异性敲除小鼠巨噬细胞上的PD-L1基因

2、实验动物背景信息

C57BL/6小鼠

3、研究背景

该动物模型的研究目的及意义；该动物模型的国内外研究进展并附参考文献。

PD-L1作为机体内重要的免疫通路分子，其在结核等疾病中的作用机制尚不明确。PD-L1广泛表达于多个免疫细胞，其中巨噬细胞是结核等疾病感染免疫的重要分子，是结核特征性肉芽肿病变的关键细胞，巨噬细胞上PD-L1表达在结核中发挥什么作用，需要巨噬细胞上PD-L1特异性敲除小鼠来进行研究。

（一）巨噬细胞上特异性小鼠制备的原理

条件性基因敲除小鼠的设计利用了位点特异性重组酶系统Cre/LoxP原理，需要在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个loxP序列，得到flox(flanked by loxP)小鼠。将flox小鼠与带有组织或细胞特异性表达cre的小鼠交配繁殖，以获得在特定细胞或者组织里把目的基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。

如下图：

图1 特异性敲除的原理

（二）条件敲除小鼠的繁殖和鉴定

1. 收到F0和F1小鼠后，首先确认每只小鼠的脚趾编号是否吻合。

2. F0和F1小鼠由于数量较少，以后需要的动物多，与野生交配，尽量多繁殖，以备后续的研究。

3. 获得小鼠后，提取基因组DNA，PCR扩增，进行基因型鉴定，并利用流式进行表型鉴定。

4. 繁殖方法有多种，以下为一种举例：

首先将PD-L1Flox/-小鼠和C57BL/6小鼠进行杂交，得到PD-L1Flox/-小鼠，然后将PD-L1Flox/-小鼠进行自交，得到PD-L1Flox/Flox小鼠，将雌性PD-L1Flox/Flox小鼠和带有巨噬细胞特异性表达 Cre 酶的Lyz2-iCre雄鼠进行杂交，得到PD-L1Flox/- with Cre小鼠，最后将PD-L1Flox/Flox小鼠和PD-L1Flox/- with Cre小鼠杂交，得到1/4的PD-L1Flox/Flox with Cre小鼠，即为巨噬细胞特异性PD-L1敲除小鼠。

1、基因鉴定：

图2 PCR鉴定敲除小鼠的基因

2、 表型分析（包括生理生化、解剖学、生物学特征等）

繁殖性能：产仔率：89～95％  平均窝产仔数：6.98～7.48只  胎间隔：28～36天  离乳存活率：87～93％

2.2 流式检测腹腔巨噬细胞、T细胞、B细胞PD-L1表达

如下图所示，表明该小鼠模型的巨噬细胞上PD-L1是特异性敲除的。

图3 流式细胞术检测巨噬细胞、T和B细胞上PD-L1的表达

注：蓝色峰为Flox/+ with cre小鼠，红色峰为Flox/Floxwith cre小鼠，绿色峰为Flox/Flox no cre小鼠

本模型不涉及除遗传物质重组对环境生态影响以外的其它安全性问题，本模型小鼠的保存、使用和处理均按照研究所伦理和安全委员会的要求执行，可以确保不产生安全性问题。

PD-L1作为机体内重要的免疫通路分子，其在结核等疾病中的作用机制尚不明确。PD-L1广泛表达于多个免疫细胞，其中巨噬细胞是结核等疾病感染免疫的重要分子，是结核特征性肉芽肿病变的关键细胞，巨噬细胞上PD-L1表达在结核中发挥什么作用，需要巨噬细胞上PD-L1特异性敲除小鼠来进行研究。

目前无文献或者资源库可以检索到巨噬细胞上PD-L1特异性敲除的动物模型，本课题组制备的模型巨噬细胞上PD-L1特异性敲除的动物模型可以用于结核或其他巨噬细胞免疫机制相关的研究，PD-L1作为机体内重要的免疫通路分子，该模型的应用必将广泛。